اصول کشت سلولی بی نقص
کشت انواع سلول ها و میکروب ها مهم ترین آزمایشی است که در آزمایشگاه های پزشکی، میکروبیولوژی، ژنتیک و … انجام می شود. سکوبندی ازمایشگاهی اصولا کشت سلولی فرایند زمانبر و بعضا دشواری است که نیاز به صبر و دقت بالایی دارد. اما نتایجی که دانشمندان و محققان از کشت های سلولی می توانند استخراج کنند، بسیار ارزشمند است. از طرف دیگر کوچک ترین خطا و آلودگی نیز می تواند نتیجه آزمایش، تلاش چندین روزه و مواد اولیه را به خطر بیاندازد. بنابراین با داشتن اطلاعات کافی درباره مشکلات رایج در کشت سلولی و برطرف کردن آن ها به صورت کاملا حرفه ای، در وقت و هزنیه که دو سرمایه گرانبها در آزمایشگاه ها هستند، صرفه جویی می شود.
مقاله پیش رو تلاشی در گردآوری مهم ترین عوامل به خطر افتادن کشت های سلولی و نحوه پیشگیری و یا رفع آن است.
مهم ترین مشکلات رایج در کشت سلولی
- آلودگی میکروبی
- رنگ محیط کشت
- مورفولوژی یا دانه بندی
- تراکم
- مشکلات کلی در بچ
- تمایز زدایی
- چگالی سید شدن سلول ها
- سرعت رشد
- …
در ادامه به برخی از مهم ترین مشکلات رایج در کشت سلولی و نحوه برطرف کردن آن ها می پردازیم.
آلودگی های میکروبی در کشت سلولی
از مهم ترین و البته سخت ترین مشکلات کشت سلولی، وجود آلودگی های میکروبی در محیط است. اگر محیط کشت سترون نباشد، باکتری، قارچ یا مایکوپلاسما می تواند وارد محیط کشت شما شود و تمام نتایجی که در انتظار آن هستید را تحت تاثیر قرار دهد. بهترین راه برای تشخیص این مشکل این است که هر روز ظرف های حاوی محیط کشت را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. اندازه باکتری ها حدود 200 میکرون است و با میکروسکوپ قابل شناسایی است. یکی از روش های دیگر بررسی حرکت های تصادفی براونی مانند است.
در صورتی که آلودگی قارچی یا باکتریایی قابل توجه باشد، بدون میکروسکوپ هم قابل تشخیص است. در این حالت حتی ممکن است رنگ محیط نیز تغییر کند.
شناسایی مایکوپلاسما پیچیده‌تر است. انجام آزمایش PCR برای بررسی وجود مایکوپلاسما پیشنهاد می شود.
افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت آلوده یکی از راهکار های ساده و کارآمد در ازبین بردن میکروب های محیط کشت سلول است.
تغییر رنگ محیط کشت سلولی
برای رشد سلول ها مواد مغذی در محیط کشت اضافه می شود. اغلب محیط های کشت دارای یک بافر pH رنگی هستند که در صورت تغییر pH، رنگ محیط نیز تغییر می کند. این تغییر رنگ اغلب به سه دلیل می تواند اتفاق بیافتد:
- سلول ها تمام مواد مغذی را مصرف کرده اند و محیط کشت نیاز به تغییر دارد.
- سلول ها مواد را از خود ترشح کرده اند که می توانند برای کشت سلولی شما سمی باشند.
- آلودگی های میکروبی نیز می توانند رنگ محیط کشت را تغییر دهند که این مورد با میکروسکوپ قابل بررسی است.
برای جلوگیری از این مشکلات، مطمئن شوید که محیط کشت خود را به طور منظم و مداوم تغییر می دهید.
مورفولوژی یا بررسی شکل ظاهری سلول ها در کشت
از مشکلات رایج در کشت سلولی تغییر شکل ظاهری سلول ها یا مروفولوژی آن هاست. در صورت تغییر غیر منظره شکل سلول ها، باید انتظار ایجاد مشکلی را در محیط کشت خود داشته باشد. به عنوان مثال تغییر در مساحت، محیط، کشیده شدن، گرد شدن و ایجاد بیرون زدگی ها از موارد مهم هستند که باید بررسی شوند.
تغییر غیر منتظره سرعت رشد در کشت سلولی
علاوه بر مورفولوژی نادرست، تکثیر سلولی نامناسب هم یکی از مشکلات کشت سلولی به شمار می آید. در صورت مشاهده تغییر ناگهانی در تکثیر سلول ها می توانید این احتمال را بدهید که محیط کشت با سلول های تهاجمی دیگری آلوده شده است. یکی از معیار های تشخیص رفتار های غیر منتظره سلول ها، محاسبه سرعت عبور آن ها از مراحل سه گانه رشد است. البته پیری سلول ها در این معیار می تواند عاملی برای کاهش سرعت رشد باشد.
مهار تماس سول ها
اگر سلول ها بیش از اندازه به هم نزیک باشند یا به اصطلاح اوور لپ داشته باشند، رشد آن ها متوقف می شود و فیزیولوژی و متابولیسم آن ها تغییر می کند. برای جلوگیری از این امر، به سلول های خود در قسمت های مختلف محیط کشت نگاه و بررسی کنید که چقدر فضای خالی در دسترس آن ها است. همانطور که سلول های شما در طول زمان رشد می کنند، شروع به دربرگرفتن تمام فضای موجود در ظرف می کنند. از روی تصاویری که هر روز گرفته می‌شوند، تلاقی را به عنوان ناحیه پوشیده شده توسط سلول‌ها تقسیم بر کل ناحیه تصویر محاسبه کنید. برای بسیاری از رده های سلولی، تلاقی بیش از 70 درصد ممکن است باعث مسمومیت محیط کشت شود.
تراکم سلولی کم در محیط کشت
فاصله زیاد سلول ها از یکدیگر نیز باعث آسیب به کشت سلولی مورد نظر شما می شود. زیرا در برخی موارد، به نظر می رسد یک تراکم سلولی حیاتی وجود دارد که غلظت کافی از فاکتور های رشد ترشح شده را ایجاد می کند و به سلول ها کمک می کند تا به طور جمعی رشد کنند. توجه داشته باشید که طبیعی است که سلول‌ها مدتی طول بکشد تا به محیط جدید خود عادت ، اسکلت سلولی خود را بازسازی، ماتریکس ترشح کنند تا به چسبندگی کمک کند، و قبل از شروع دوباره تکثیر روی بستر پخش شوند. بنابراین سلول ها در غلظتی کمتر از حد مطلوب احتمالاً قادر به رشد طبیعی نخواهند بود.
پیری سلول های محیط کشت
اگر سلول ها به دفعات پاساژ شوند، پیر و فرسوده شده اند. بنابراین سرعت رشد آن ها نیز پایین می آید، حتی اگر فضای کافی و مناسبی برای رشد در دسترس داشته باشند. پس برای این که مشکلات کشت سلولی کاهش یابد، تعداد دفعاتی که سلول محیط کشت پاساژ می شود را یادداشت کنید.
مشکلات اساسی در یک بچ
به طور کلی برای اطمینان از مقدار کافی سلول برای تکرار آزمایش ها با یک منبع مشخص باید بچی از سلول های یکسان را آماده و در ویال ها فریز کرد. تا این جا در مورد مشکلات رایج در کشت سلولی حین اجرای پروتکل های کشت بحث کردیم، اما باید هنگام تهیه بچ ها پیش از شروع کشت نیز دقت کافی داشت. زیرا یک اشتباه در این مرحله می‌تواند بر روی تمام آزمایش‌های آینده شما تأثیر بگذارد. اگر سلول های یک ویال رفتاری غیر عادی (مورفولوژی، سرعت رشد، آلودگی) از خود نشان دادند، دلیل مناسبی است که کل بچ را دور بریزید.
اصول کشت سلولی بی نقص
کشت انواع سلول ها و میکروب ها مهم ترین آزمایشی است که در آزمایشگاه های پزشکی، میکروبیولوژی، ژنتیک و … انجام می شود. سکوبندی ازمایشگاهی اصولا کشت سلولی فرایند زمانبر و بعضا دشواری است که نیاز به صبر و دقت بالایی دارد. اما نتایجی که دانشمندان و محققان از کشت های سلولی می توانند استخراج کنند، بسیار ارزشمند است. از طرف دیگر کوچک ترین خطا و آلودگی نیز می تواند نتیجه آزمایش، تلاش چندین روزه و مواد اولیه را به خطر بیاندازد. بنابراین با داشتن اطلاعات کافی درباره مشکلات رایج در کشت سلولی و برطرف کردن آن ها به صورت کاملا حرفه ای، در وقت و هزنیه که دو سرمایه گرانبها در آزمایشگاه ها هستند، صرفه جویی می شود.
مقاله پیش رو تلاشی در گردآوری مهم ترین عوامل به خطر افتادن کشت های سلولی و نحوه پیشگیری و یا رفع آن است.
مهم ترین مشکلات رایج در کشت سلولی
- آلودگی میکروبی
- رنگ محیط کشت
- مورفولوژی یا دانه بندی
- تراکم
- مشکلات کلی در بچ
- تمایز زدایی
- چگالی سید شدن سلول ها
- سرعت رشد
- …
در ادامه به برخی از مهم ترین مشکلات رایج در کشت سلولی و نحوه برطرف کردن آن ها می پردازیم.
آلودگی های میکروبی در کشت سلولی
از مهم ترین و البته سخت ترین مشکلات کشت سلولی، وجود آلودگی های میکروبی در محیط است. اگر محیط کشت سترون نباشد، باکتری، قارچ یا مایکوپلاسما می تواند وارد محیط کشت شما شود و تمام نتایجی که در انتظار آن هستید را تحت تاثیر قرار دهد. بهترین راه برای تشخیص این مشکل این است که هر روز ظرف های حاوی محیط کشت را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. اندازه باکتری ها حدود 200 میکرون است و با میکروسکوپ قابل شناسایی است. یکی از روش های دیگر بررسی حرکت های تصادفی براونی مانند است.
در صورتی که آلودگی قارچی یا باکتریایی قابل توجه باشد، بدون میکروسکوپ هم قابل تشخیص است. در این حالت حتی ممکن است رنگ محیط نیز تغییر کند.
شناسایی مایکوپلاسما پیچیده‌تر است. انجام آزمایش PCR برای بررسی وجود مایکوپلاسما پیشنهاد می شود.
افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت آلوده یکی از راهکار های ساده و کارآمد در ازبین بردن میکروب های محیط کشت سلول است.
تغییر رنگ محیط کشت سلولی
برای رشد سلول ها مواد مغذی در محیط کشت اضافه می شود. اغلب محیط های کشت دارای یک بافر pH رنگی هستند که در صورت تغییر pH، رنگ محیط نیز تغییر می کند. این تغییر رنگ اغلب به سه دلیل می تواند اتفاق بیافتد:
- سلول ها تمام مواد مغذی را مصرف کرده اند و محیط کشت نیاز به تغییر دارد.
- سلول ها مواد را از خود ترشح کرده اند که می توانند برای کشت سلولی شما سمی باشند.
- آلودگی های میکروبی نیز می توانند رنگ محیط کشت را تغییر دهند که این مورد با میکروسکوپ قابل بررسی است.
برای جلوگیری از این مشکلات، مطمئن شوید که محیط کشت خود را به طور منظم و مداوم تغییر می دهید.
مورفولوژی یا بررسی شکل ظاهری سلول ها در کشت
از مشکلات رایج در کشت سلولی تغییر شکل ظاهری سلول ها یا مروفولوژی آن هاست. در صورت تغییر غیر منظره شکل سلول ها، باید انتظار ایجاد مشکلی را در محیط کشت خود داشته باشد. به عنوان مثال تغییر در مساحت، محیط، کشیده شدن، گرد شدن و ایجاد بیرون زدگی ها از موارد مهم هستند که باید بررسی شوند.
تغییر غیر منتظره سرعت رشد در کشت سلولی
علاوه بر مورفولوژی نادرست، تکثیر سلولی نامناسب هم یکی از مشکلات کشت سلولی به شمار می آید. در صورت مشاهده تغییر ناگهانی در تکثیر سلول ها می توانید این احتمال را بدهید که محیط کشت با سلول های تهاجمی دیگری آلوده شده است. یکی از معیار های تشخیص رفتار های غیر منتظره سلول ها، محاسبه سرعت عبور آن ها از مراحل سه گانه رشد است. البته پیری سلول ها در این معیار می تواند عاملی برای کاهش سرعت رشد باشد.
مهار تماس سول ها
اگر سلول ها بیش از اندازه به هم نزیک باشند یا به اصطلاح اوور لپ داشته باشند، رشد آن ها متوقف می شود و فیزیولوژی و متابولیسم آن ها تغییر می کند. برای جلوگیری از این امر، به سلول های خود در قسمت های مختلف محیط کشت نگاه و بررسی کنید که چقدر فضای خالی در دسترس آن ها است. همانطور که سلول های شما در طول زمان رشد می کنند، شروع به دربرگرفتن تمام فضای موجود در ظرف می کنند. از روی تصاویری که هر روز گرفته می‌شوند، تلاقی را به عنوان ناحیه پوشیده شده توسط سلول‌ها تقسیم بر کل ناحیه تصویر محاسبه کنید. برای بسیاری از رده های سلولی، تلاقی بیش از 70 درصد ممکن است باعث مسمومیت محیط کشت شود.
تراکم سلولی کم در محیط کشت
فاصله زیاد سلول ها از یکدیگر نیز باعث آسیب به کشت سلولی مورد نظر شما می شود. زیرا در برخی موارد، به نظر می رسد یک تراکم سلولی حیاتی وجود دارد که غلظت کافی از فاکتور های رشد ترشح شده را ایجاد می کند و به سلول ها کمک می کند تا به طور جمعی رشد کنند. توجه داشته باشید که طبیعی است که سلول‌ها مدتی طول بکشد تا به محیط جدید خود عادت ، اسکلت سلولی خود را بازسازی، ماتریکس ترشح کنند تا به چسبندگی کمک کند، و قبل از شروع دوباره تکثیر روی بستر پخش شوند. بنابراین سلول ها در غلظتی کمتر از حد مطلوب احتمالاً قادر به رشد طبیعی نخواهند بود.
پیری سلول های محیط کشت
اگر سلول ها به دفعات پاساژ شوند، پیر و فرسوده شده اند. بنابراین سرعت رشد آن ها نیز پایین می آید، حتی اگر فضای کافی و مناسبی برای رشد در دسترس داشته باشند. پس برای این که مشکلات کشت سلولی کاهش یابد، تعداد دفعاتی که سلول محیط کشت پاساژ می شود را یادداشت کنید.
مشکلات اساسی در یک بچ
به طور کلی برای اطمینان از مقدار کافی سلول برای تکرار آزمایش ها با یک منبع مشخص باید بچی از سلول های یکسان را آماده و در ویال ها فریز کرد. تا این جا در مورد مشکلات رایج در کشت سلولی حین اجرای پروتکل های کشت بحث کردیم، اما باید هنگام تهیه بچ ها پیش از شروع کشت نیز دقت کافی داشت. زیرا یک اشتباه در این مرحله می‌تواند بر روی تمام آزمایش‌های آینده شما تأثیر بگذارد. اگر سلول های یک ویال رفتاری غیر عادی (مورفولوژی، سرعت رشد، آلودگی) از خود نشان دادند، دلیل مناسبی است که کل بچ را دور بریزید.
از ثبت تا انحلال موسسات غیر تجاری